Thèse : Faire progresser les études in vitro des interactions cellule-glycocalyx : développement d’une plateforme définie mécaniquement et biochimiquement - Oksana Kirichuk

Directeurs de thèse : Delphine DEBARRE, Lionel BUREAU, Ralf RICHTER (University of Leeds, UK)

Membres du jury : Olivier THEODOLY (Inserm), Marta BALLY (Umeå University, Sweden), Emmanuelle PLANUS (IAB, UGA), Liliane COCHE-GUERENTE (DCM, UGA)

Résumé : L’adhésion des cellules à la paroi des vaisseaux sanguins est un processus complexe. Les globules rouges doivent s’éloigner de la paroi du vaisseau pour éviter la formation de caillots,tandis que les cellules immunitaires peuvent migrer dans les tissus. Ce processus repose sur le glycocalyx, une couche de macromolécules couvrant la paroi des vaisseaux. Cependant, nous ne comprenons pas complètement comment les propriétés du glycocalyx (souplesse, épaisseur, composition des récepteurs) affectent cette régulation. Notre hypothèse est que l’adhésion sélective des cellules fait intervenir des facteurs mécaniques et biochimiques. Il est difficile d’étudier ce phénomène dans de vrais vaisseaux sanguins, c’est pourquoi mon étude s’est concentrée sur le développement d’une plateforme in vitro. Cette plateforme combine un modèle de glycocalyx avec des modèles synthétiques de globules blancs sous flux, permettant un contrôle précis des paramètres physiques et biochimiques du modèle de glycocalyx et des modèles de cellules. Le modèle de glycocalyx nouvellement développé comprend plusieurs ingrédients clés dont les propriétés sont étroitement contrôlées : une brosse d’acide hyaluronique (HA, un composantessentiel du glycocalyx endothélial) est combinée à la sélectine P (une molécule d’adhésion à la surface des cellules endothéliales qui joue un rôle essentiel dans l’orientation des leucocytes). En m’appuyant sur l’expérience précédente de mon groupe de recherche, j’ai utilisé une bicouche lipidique supportée sur une lamelle de verre (SLB) portant une monocouche de streptavidine (SAv), qui peut lier des molécules biotinylées par l’intermédiaire de liaisons biotine-SAv. Je présente ici un contrôle de la mobilité dans le plan des molécules ancrées à la bicouche lipidique fluide en utilisant le glutaraldéhyde (GTA) comme agent de réticulation pour la SAv. Des densités de greffage contrôlées de chaînes d’HA biotinylées à une extrémité et de différentes longueurs permettent de créer des brosses aux propriétés mécaniques différentes. Je présente également une nouvelle méthodologie permettant d’ajuster quantitativement la densité de greffage de molécules biotinylées plus petites, qui est utilisée ici pour contrôler la densité de greffage d’une "protéine adaptatrice" pour l’ancrage de la P-sélectine. Le nouveau modèle in vitro du glycocalyx permet ainsi de contrôler la mobilité latérale, la densité de surface et l’orientation de deux molécules fonctionnelles distinctes.Le deuxième élément clé de la nouvelle plateforme consiste en des modèles de globules blancs, développés sur la base de microbilles disponibles dans le commerce ayant la taille d’une cellule et une fonctionalisation de surface avec de la SAv. Je présente une méthodologie pour le greffage simultané de deux types de protéines à la surface des billes : CD44 biotinylé (un ligand exprimé à la surface des leucocytes, interagissant spécifiquement avec l’HA) et PSGL-1 (un ligand de la P-sélectine). En outre, je présente une méthode permettant de contrôler la densité de surface de chacune de ces protéines.J’utilise une combinaison de méthodes comme outils de quantification et de contrôle de la qualité de la formation du modèle de glycocalyx et de la fonctionnalisation des billes : microbalanceà quartz avec mesure de dissipation (QCM-D) ; ellipsométrie spectroscopique (SE), microscopie à contraste interférentiel par réflexion (RICM) ; microscopie confocale avec redistribution de fluorescence après photoblanchiment (FRAP), et cytométrie en flux. Cette plateforme nouvellement établie offre des conditions contrôlées pour l’étude de l’adhésion des cellules sanguines, reliant les interactions chimiques cellule-glycocalyx et les aspects mécaniques de la migration cellulaire sous flux. Elle est facilement complexifiable ou adaptable, permettant une compréhension de plus en plus fine de l’adhésion des cellules aux vaisseaux sanguins.